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(相關(guān)資料圖)
2021年03月02日，杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的分子遺傳學(xué)和微生物學(xué)系Stacy M. Horner教授團(tuán)隊(duì)在《Cell Reports》（IF: 9.995）雜志發(fā)表了題為“Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine”的研究論文，研究通過(guò)MeRIP-seq（m6A-seq）等實(shí)驗(yàn)揭示了m6A在抗病毒限制的I型干擾素（interferon，IFN）響應(yīng)期間對(duì)IFN刺激基因（IFN-stimulated genes ，ISG）翻譯的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine
時(shí)間：2021.03.02
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 9.995
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、Ribo-seq、MeRIP-qRT-PCR、熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)等
研究摘要
I型干擾素（interferon，IFN）通過(guò)誘導(dǎo)數(shù)百種IFN刺激基因（ISG）來(lái)響應(yīng)病毒感染，必須調(diào)節(jié)這些ISG的誘導(dǎo)以實(shí)現(xiàn)有效和可調(diào)控的抗病毒感染響應(yīng)，但這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究首先鑒定了RNA堿基修飾N6-甲基腺苷（m6A）在ISG調(diào)控中的作用，通過(guò)Ribo-seq和定量質(zhì)譜法結(jié)合m6A免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）分析，鑒定出包含IFITM1的ISG亞群，其翻譯通過(guò)m6A和m6A甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白METTL3和METTL14增強(qiáng)。研究進(jìn)一步表明m6A識(shí)別蛋白（readers）YTHDF1以m6A結(jié)合依賴性方式上調(diào)IFITM1表達(dá)，且m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體可以促進(jìn)I型IFN的抗病毒活性。總之，本研究表明m6A在抗病毒限制的I型IFN響應(yīng)期間對(duì)ISG翻譯的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）METTL3/14調(diào)節(jié)某些ISG的翻譯
IFN-β通過(guò)誘導(dǎo)ISG轉(zhuǎn)錄形成對(duì)病毒感染的響應(yīng)。為研究m6A是否調(diào)節(jié)I型IFN響應(yīng)，本研究對(duì)Huh7細(xì)胞中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體METTL3/14缺失后，IFN-β誘導(dǎo)的幾種具有抗病毒功能的ISG表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。在METTL3/14敲除后，IFN-β誘導(dǎo)的ISG IFITM1和MX1蛋白表達(dá)降低（圖1A），同時(shí)在A549細(xì)胞、原代新生兒人真皮成纖維細(xì)胞（NHDF）和Huh7細(xì)胞中IFN-β處理后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（8h、16h和24h）觀察到相似結(jié)果；但MX1蛋白水平在A549和NHDF細(xì)胞中的影響不如在Huh7細(xì)胞中強(qiáng)烈。而為響應(yīng)IFN-β，METTL3/14過(guò)表達(dá)增加了Huh7細(xì)胞中的IFITM1和MX1豐度，但沒有增加ISG15和EIF2AK2的豐度（圖1B）。METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG IFITM1和MX1在沒有IFN-β的情況下不表達(dá)，表明METTL3/14動(dòng)態(tài)變化對(duì)內(nèi)源性IFN-β的任何混雜效應(yīng)可以忽略不計(jì)（圖1A和1B）。
圖1：METTL3/14調(diào)節(jié)某些ISG的翻譯
（A-B）在模擬或IFN-β（24h）處理之前，用siRNA轉(zhuǎn)染METTL3/14（M3/14）或?qū)φ眨–TRL）（A）或穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FLAG-METTL14（M3/14OE；上箭頭表示FLAG-METTL14；下箭頭表示內(nèi)源性METTL14）（B）的Huh7細(xì)胞提取物的免疫印跡分析。相對(duì)于非靶向?qū)φ眨╯iCTRL）+IFN-β（A）或WT+IFN-（B），對(duì)A和B中4個(gè)重復(fù)的相對(duì)ISG表達(dá)進(jìn)行定量。
（C-E）用CTRL或METTL3/14 siRNA轉(zhuǎn)染后經(jīng)IFN-β處理的Huh7細(xì)胞提取物中分離24個(gè)蔗糖梯度級(jí)分中的IFITM1（C）、MX1（D）和GAPDH（E）mRNA相對(duì)百分比qRT-PCR分析。未初始化（游離、40S和60S亞基）、初始化（80S）、低分子量或高分子量多核糖體。右邊的圖表顯示了IFITM1、MX1或GAPDH組合級(jí)分中的mRNA百分比。將各部分的百分比相加得出各類別的總百分比。
數(shù)值為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)（A和B）的平均值±SEM，3個(gè)技術(shù)重復(fù)平均值±SD，表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)（C–E，左圖）和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM（C–E，右圖）。*非配對(duì)Student"s t檢驗(yàn)（A和B）和Sidak多重比較檢驗(yàn)的雙向方差分析（C–E），*p<0.05，***p<0.01，***p<0.005，ns，不顯著。
為研究METTL3/14如何調(diào)節(jié)某些ISG的蛋白水平，研究首先分析METTL3/14缺失是否導(dǎo)致ISG mRNA對(duì)IFN-β響應(yīng)減少。同時(shí)，在IFN-β處理后使用RNA測(cè)序（RNA-seq），結(jié)果顯示METTL3/14缺失對(duì)核心ISG的mRNA表達(dá)豐度影響很小，表明ISG RNA穩(wěn)定性不受METTL3缺失的影響。
由于METTL3/14缺失導(dǎo)致IFITM1和MX1蛋白減少而不影響其轉(zhuǎn)錄水平，本研究分析METTL3/14是否調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明METTL3/14不能檢測(cè)到Huh7細(xì)胞中這些ISG的出核或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
為了檢測(cè)METTL3/14是否調(diào)節(jié)IFITM1翻譯，作者檢測(cè)了其在對(duì)照細(xì)胞或IFN-β處理后METTL3/14缺失的細(xì)胞中的多核糖體（polysome）百分比。結(jié)果顯示METTL3/14缺失不改變總多核糖體水平，但METTL3/14缺失會(huì)導(dǎo)致80S級(jí)分中IFITM1 mRNA水平較低，且從重多核糖體級(jí)分轉(zhuǎn)換為輕多核糖體級(jí)分（圖1C），表明METTL3/14缺失后IFITM1翻譯受損。另外，在MX1（圖1D）中也觀察到類似但不太明顯的變化，但在GAPDH（圖1E）中沒有觀察到。總之結(jié)果表明，METTL3/14調(diào)節(jié)某些ISG的翻譯，如IFITM1和MX1。
（2）METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG被m6A修飾
為確定METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG IFITM1和MX1以及其他ISG是否被m6A修飾，研究通過(guò)使用甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）在Huh7細(xì)胞中繪制了IFN誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜，在鑒定出ISG后，將m6A免疫沉淀后reads覆蓋率的peaks，與使用MeTDiff m6A peaks calling的input進(jìn)行比較。結(jié)果顯示mRNA peaks在編碼序列末端和3′UTR起始位點(diǎn)富集（圖2A）。peaks內(nèi)最富集的RNA序列motif為[U/A]GGAC，這與DRAmC已知m6A motif匹配（圖2A）。約85%的ISG（分類為IFN后上調(diào)超過(guò)4倍的ISG）被m6A修飾，而Huh7細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄組中比例為74%（平均覆蓋率≥10）（圖2B）。該結(jié)果與先前的研究一致，該研究發(fā)現(xiàn)ISG以與轉(zhuǎn)錄組相似的百分比進(jìn)行m6A修飾。m6A修飾的ISG百分比在其他類別的ISG中相似，包括脊椎動(dòng)物中進(jìn)化保守的“核心”ISG和具有已知抗病毒功能的核心ISG的14個(gè)亞群（圖2B）。接下來(lái)，利用MeRIP-seq數(shù)據(jù)生成了IFITM1、MX1、ISG15和EIF2AK2圖，并使用m6A peaks calling 方法MeTDiff和meRIPPer揭示METTL3/14調(diào)節(jié)基因IFITM1和MX1具有m6A peaks（圖2C和2D），而ISG15和EIF2AK2沒有m6A peaks（圖2E和2F），這些圖表明ISG15的3"UTR也可能包含m6A位點(diǎn)（圖2E）。將MeRIP-seq實(shí)驗(yàn)中ISG的m6A狀態(tài)與已發(fā)表的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，比較結(jié)果顯示在所有研究中核心抗病毒ISG的m6A狀態(tài)預(yù)測(cè)一致。dsDNA處理有效地激活I(lǐng)FN產(chǎn)生并誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的相同核心抗病毒ISG的m6A修飾。HCMV感染也導(dǎo)致某些ISG的m6A修飾，這種病毒編碼抑制IFN信號(hào)因子；因此ISG可能不像dsDNA或IFN-β處理那樣強(qiáng)烈誘導(dǎo)。m6A在許多ISG上的存在表明m6A可以調(diào)節(jié)抗病毒I型IFN響應(yīng)。
圖2：METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG由m6A修飾
（A） 在IFN-β處理（8h）后，轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m6A分布Metagene圖，繪制了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的peaks 中DRACH motif位點(diǎn)相對(duì)位置，以及peaks中最富集的motif。
（B） 在表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組中由m6A修飾的基因百分比，響應(yīng)于IFN-β處理（ISG）的mRNA誘導(dǎo)≥4倍的基因，脊椎動(dòng)物中保守的核心ISG，或具有抗病毒功能的核心ISG亞群。
（C-F）在IFITM1（C）、MX1（D）、ISG15（E）和EIF2AK2（F）轉(zhuǎn)錄本中MeRIP（紅色）和input（黑色）reads覆蓋圖。生物學(xué)重復(fù)的差異由reads覆蓋范圍周圍的紅色和黑色陰影表示，灰色陰影表示編碼序列，黃色陰影表示由MeTDiff和meRIPPer的m6A peaks calling軟件。所有分析均在3個(gè)生物學(xué)重復(fù)上進(jìn)行。
（3）IFITM1在3′UTR中的m6A修飾增強(qiáng)了其翻譯
m6A增強(qiáng)了某些mRNA的翻譯。具體而言，m6A識(shí)別蛋白（readers）YTHDF1在3′UTR內(nèi)識(shí)別m6A，并與真核翻譯起始因子（如eIF3）結(jié)合，以增強(qiáng)m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的翻譯。為METTL3/14對(duì)ISG的翻譯調(diào)節(jié)是否是通過(guò)m6A誘導(dǎo)，研究使用IFITM1作為METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG模型。首先確定METTL3/14缺失對(duì)IFITM1 m6A修飾的影響。MeRIP-qRT-PCR結(jié)果表明IFITM1 mRNA在m6A陰性ISG EIF2AK2和m6A陰性合成RNA中富集，證實(shí)其含有m6A。METTL3/14缺失降低了IFITM1 mRNA的m6A富集，但沒有降低m6A陰性EIF2AK2轉(zhuǎn)錄本或m6A陰性合成RNA的富集（圖3A和3B），數(shù)據(jù)表明IFITM1是由METTL3/14修飾的m6A。
圖3：IFITM1在 3"UTR中的m6A修飾增強(qiáng)了翻譯
（A） 在用siCTRL或METTL3/14 siRNA處理并摻入m6A陰性（NEG）寡核苷酸的Huh7細(xì)胞中，由IFN-β（8h）誘導(dǎo)的ISG的相對(duì)m6A水平的代表性MeRIP qRT-PCR分析。
（B） A中5個(gè)生物學(xué)重復(fù)每個(gè)基因的相對(duì)富集百分比，歸一化為siCTRL。
（C） 野生型（WT）和突變型ISRE-m6A缺失的Renilla熒光素酶（R-Luc）IFITM1 3"UTR報(bào)告基因示意圖，該報(bào)告基因也從單獨(dú)的啟動(dòng)子表達(dá)m6A缺失的螢火蟲熒光素酶（F-Luc）。
（D）經(jīng)IFN-β（8h）處理的轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞的WT和m6A-mut IFITM1 3"UTR報(bào)告RNA的相對(duì)m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析。
（E）用siRNA轉(zhuǎn)染的Huh7（24h）、然后進(jìn)行報(bào)告基因轉(zhuǎn)染（24h）和用IFN-β處理（8h）的WT和m6A-mut IFITM1 3"UTR報(bào)告基因RNA的相對(duì)m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析，。
（F） 報(bào)告基因轉(zhuǎn)染（24h）和IFN-β處理（8h）后，在Huh7細(xì)胞中歸一化為HPRT1的WT和m6A-mut IFITM1 3"UTR報(bào)告基因mRNA表達(dá)的qRT-PCR分析。
（G） IFN-β誘導(dǎo)的WT和m6A-mut IFITM1 3′UTR報(bào)告基因中的相對(duì)螢光素酶活性（R-Luc/F-Luc）（相對(duì)于模擬8h）。
在鑒定出IFITM1是m6A修飾之后，接下來(lái)生成了一個(gè)熒光素酶報(bào)告基因，其中包含IFN刺激的響應(yīng)元件（ISRE）-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Renilla螢光素酶，所有DRAC motif被敲除（m6A-null R-Luc），然后與野生型（WT）IFITM1 3′UTR或類似的3′UTR序列結(jié)合，IFITM1中3′UTR m6A peaks中的四個(gè)推定m6A motif從A→G轉(zhuǎn)換（m6A-mut）（圖3C）。分析數(shù)據(jù)結(jié)果表明， METTL3/14通過(guò)向3"UTR添加m6A修飾來(lái)調(diào)節(jié)IFITM1翻譯，并且IFITM1 3"UTR內(nèi)的m6A修飾足以增強(qiáng)其翻譯。
（4）YTHDF1以m6A依賴性方式增強(qiáng)IFITM1蛋白表達(dá)
為檢測(cè)YTHDF1是否誘導(dǎo)m6A對(duì)ISG的翻譯促進(jìn)作用，研究人員在Huh7細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)YTHDF1（H7Y1）或m6A結(jié)合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）并分析其相對(duì)于親本Huh7細(xì)胞（H7）在24h后IFN誘導(dǎo)的ISG表達(dá)。YTHDF1過(guò)表達(dá)增加響應(yīng)IFN-β的IFITM1蛋白表達(dá)，而m6A結(jié)合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）的過(guò)表達(dá)不增加IFITM1豐度（圖4A和4B）。且野生型（WT）和突變型YTHDF1過(guò)表達(dá)不會(huì)顯著影響IFN-β處理后的IFITM1 mRNA水平，表明YTHDF1不直接調(diào)控IFN信號(hào)或IFITM1 mRNA穩(wěn)定性（圖4C）。YTHDF1過(guò)表達(dá)顯著改變IFN誘導(dǎo)的含m6A的ISG MX1表達(dá)，或不含m6A的ISG ISG15和EIF2AK2表達(dá)（圖4A和4B）。而在IFN-β處理后，YTHDF1缺失會(huì)導(dǎo)致IFITM1蛋白表達(dá)降低，但MX1、ISG15和EIF2AK2未受影響（圖4D）。另外，WT YTHDF1與IFITM1、MX1、ISG15和m6A陽(yáng)性對(duì)照SON的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，而m6A結(jié)合缺陷型YTHDF1突變蛋白則沒有結(jié)合。含有非m6A的mRNA EIF2AK2和RPL30不與任一蛋白結(jié)合（圖4E和4F）。總之，這些結(jié)果表明YTHDF1與IFITM1 mRNA上的m6A結(jié)合，且通過(guò)其m6A結(jié)合活性增強(qiáng)其翻譯是必要和充分的。YTHDF1與ISG15 mRNA明顯的m6A依賴性結(jié)合表明ISG15 mRNA實(shí)際上是m6A修飾。在ISG15 mRNA的input reads與MeRIP-seq reads的關(guān)聯(lián)圖揭示了其3"UTR中m6A富集的潛在區(qū)域（圖2E）。因此，YTHDF1在促進(jìn)翻譯中具有轉(zhuǎn)錄本特異性作用，因?yàn)樗Y(jié)合了IFITM1、MX1和ISG15的轉(zhuǎn)錄本，但其過(guò)表達(dá)僅足以顯著增加IFITM1的蛋白生成。
圖4：YTHDF1以m6A依賴性方式增強(qiáng)IFITM1蛋白表達(dá)
（A） 在模擬或IFN-β（24h）處理后穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或FLAG-YTHDF1 W465A（Huh7Y1mut）的Huh7細(xì)胞提取物的免疫印跡分析。
（B） A的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中IFN-β處理后ISG表達(dá)定量，歸一化為總蛋白并相對(duì)于siCTRL繪圖。
（C） 在IFN-β（24h）處理后穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或W465A（Huh7Y1mut）的Huh7細(xì)胞中歸一化為HPRT1的ISG mRNA表達(dá)的qRT-PCR分析。
（D） 在模擬或IFN-β（24h）處理之前，用siRNA轉(zhuǎn)染YTHDF1（siY1）或siCTRL的Huh7細(xì)胞提取物的免疫印跡分析。數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
（E） 與IFN-β（8h）處理后Huh7細(xì)胞的FLAG-GFP相比，F(xiàn)LAG-YTHDF1 WT（Y1）或W465A（Y1mut）的免疫沉淀（IP）后mRNA富集的qRT-PCR分析。將IP值歸一化為input值并繪制為GFP的倍數(shù)富集。
（F） E中使用的FLAG免疫沉淀和input級(jí)分的免疫印跡分析。
（5）METTL3/14和m6A促進(jìn)ISG亞群的翻譯
為鑒定蛋白表達(dá)受METTL3/14調(diào)節(jié)的其他ISG，使用基于定量質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)和氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC）來(lái)比較IFN-β處理后siCTRL和siMETTL3/14細(xì)胞的蛋白質(zhì)組。與siCTRL相比，siMETTL3/14對(duì)蛋白豐度的影響集中在大多蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)比為0，表明METTL3/14缺失對(duì)IFN-β處理后的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有整體影響。在先前的RNA-seq實(shí)驗(yàn)中，將ISG定義為通過(guò)IFN-β處理上調(diào)>2倍的基因來(lái)確定哪些蛋白是ISG。盡管質(zhì)譜法檢測(cè)ISG有限（n=18），但鑒定出一些METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG（圖5A；MS）。METTL3/14缺失后，大多數(shù)這些ISG的蛋白表達(dá)降低，且這些ISG包括先前鑒定的m6A修飾的IFITM1（對(duì)應(yīng)于IFITM1/2/3的肽）和MX1，以及其他抗病毒ISG如OAS2和不同的HLA-C鏈（圖5A），均由m6A修飾。通過(guò)將這些數(shù)據(jù)與之前的RNA-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明METTL3/14對(duì)這些ISG蛋白水平的影響不由其mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)來(lái)確定，因?yàn)镸ETTL3/14缺失后，本實(shí)驗(yàn)中在蛋白水平上降低的ISG的mRNA豐度沒有降低，表明翻譯調(diào)控如先前對(duì)IFITM1和MX1的多核糖體分析所表明結(jié)果一致（圖1C和1D；圖5A，RNA）。并非所有通過(guò)質(zhì)譜法鑒定的m6A修飾的ISG都受METTL3/14缺失調(diào)節(jié)（圖5A；m6A），表明METTL3/14和m6A調(diào)節(jié)ISG的亞群并支持其蛋白表達(dá)。
圖5：METTL3/14調(diào)節(jié)ISG亞群的翻譯
（A） 3列熱圖顯示了IFN-β處理后METTL3/14缺失對(duì)Huh7細(xì)胞中ISG表達(dá)的影響。第一列顯示定量質(zhì)譜法檢測(cè)蛋白質(zhì)估計(jì)值的log2倍變化（siMETTL3/14與siCTRL + IFN-β 24 h；n=2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。第二列顯示獨(dú)立RNA-seq實(shí)驗(yàn)（siMETTL3/14與siCTRL + IFN-β 8 h；n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的mRNA reads的log2倍變化。第三列顯示MeRIP-seq數(shù)據(jù)的m6A狀態(tài)（+表示m6A陽(yáng)性；-表示m6A陰性）（+IFN-β 8h；n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。基因包括RNA-seq的IFN誘導(dǎo)超過(guò)2倍的任何ISG，這些ISG也可以通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)到，其他圖中的ISG以粗體顯示。由于IFITM1/2/3相似，因此使用此表示法表示從該蛋白質(zhì)家族中檢測(cè)到的肽；RNA-seq倍數(shù)變化和m6A狀態(tài)對(duì)應(yīng)于帶下劃線的數(shù)字，調(diào)整后*p<0.05。
（B） METTL3/14缺失對(duì)ISG表達(dá)影響的四象限散點(diǎn)圖。y軸是Ribo-seq的核糖體保護(hù)片段的log2倍變化（siMETTL3/14超過(guò)siCTRL），x軸是來(lái)自獨(dú)立RNA-seq實(shí)驗(yàn)的mRNA讀數(shù)的log2倍變化（siMETTL3/14與siCTRL）。m6A修飾（藍(lán)色）或m6A陰性（灰色）基因。對(duì)其他圖中的ISG進(jìn)行了標(biāo)記。
（6）METTL3/14增強(qiáng)了IFN響應(yīng)的抗病毒作用
METTL3/14在I型IFN響應(yīng)期間增強(qiáng)ISG亞群表達(dá)，表明它可能是最佳抗病毒所必需。研究人員檢測(cè)了METTL3/14動(dòng)態(tài)變化后I型IFN限制負(fù)義鏈RNA病毒水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的能力。VSV基因組包含了m6Am帽修飾，但由于這種修飾沉積不受METTL3/14調(diào)控，因此VSV復(fù)制可能不會(huì)受到METTL3/14動(dòng)態(tài)變化的直接影響，而對(duì)VSV復(fù)制的任何影響可能由宿主轉(zhuǎn)錄本的甲基化介導(dǎo)。通過(guò)使用小干擾RNA（siRNA）或過(guò)表達(dá)來(lái)干擾METTL3/14的表達(dá)，然后使用顯微鏡在存在和不存在低劑量IFN-β預(yù)處理（6h；40U/mL）的情況下，檢測(cè)感染后6小時(shí)被VSV感染的細(xì)胞百分比。在感染后早期時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)VSV感染，可以在感染直接誘導(dǎo)的ISG細(xì)胞上調(diào)之前檢測(cè)到病毒復(fù)制。結(jié)果顯示，在沒有IFN-β預(yù)處理的情況下，任何條件下都沒有看到VSV誘導(dǎo)ISG（圖6A和6B）。通過(guò)免疫印跡或定量感染細(xì)胞百分比分析來(lái)檢測(cè)VSV復(fù)制，在沒有IFN-β處理情況下，METTL3/14缺失或過(guò)表達(dá)沒有變化（圖6）。在IFN-β預(yù)處理后，METTL3/14缺失導(dǎo)致METTL3/14調(diào)節(jié)的ISG表達(dá)降低（圖6A），而METTL3/14過(guò)表達(dá)則上調(diào)其表達(dá)（圖6B）。盡管IFN-β預(yù)處理減少了VSV病毒復(fù)制，但METTL3/14缺失降低了IFN-β限制VSV的能力，而METTL3/14過(guò)表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)IFN介導(dǎo)的VSV限制（圖6）。總之這些數(shù)據(jù)表明METTL3/14增強(qiáng)了I型IFN的抗病毒特性，是有效IFN介導(dǎo)的抗病毒響應(yīng)所必需的。
圖6：METTL3/14增強(qiáng)了I型IFN響應(yīng)的抗病毒作用
（A-B） 用siRNA（A）轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FLAG-METTL14的Huh7細(xì)胞提取物的代表性免疫印跡分析（n=3），其也增強(qiáng)METTL3表達(dá)（M3/14OE）；用IFN-β（6h）或模擬物處理，然后進(jìn)行VSV感染（MOI=2；6h）（B）。箭頭表示FLAG-METTL14（上）和內(nèi)源性METLL14（下）。
（C-D） 用siCTRL或METTL3/14 siRNA（C）或穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FLAG-METTL14（METTL3/14OE；D）處理的Huh7細(xì)胞的代表性顯微圖，這些細(xì)胞用IFN-β預(yù)處理（6h），然后進(jìn)行VSV感染（MOI=2；6h），對(duì)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)感染的細(xì)胞百分比進(jìn)行定量，每個(gè)條件5個(gè)視野，每個(gè)視野>150個(gè)細(xì)胞，歸一化為未經(jīng)IFN處理的siCTRL或WT，如右圖所示。比例尺：100μm。
關(guān)于易基因RNA m6A甲基化測(cè)序(MeRIP-seq)技術(shù)
易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的m6A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷響應(yīng)、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物響應(yīng)等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)。
大樣本量m6A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個(gè)樣品價(jià)格高，通常難以承擔(dān)。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實(shí)現(xiàn)不同樣本間相對(duì)定量，降低檢測(cè)成本。
易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測(cè)序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測(cè)序（MeRIP-seq2）
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
- 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
- 轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA；
- 樣本要求：可用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)；
- 重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，最大化降低抗體富集偏差；
- 應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷響應(yīng)、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物響應(yīng)等研究領(lǐng)域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要運(yùn)用在分子機(jī)制的理論性研究
- 疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾病（如肥胖/糖尿病）、神經(jīng)和精神疾病（如阿爾茲海默癥/抑郁癥）、炎癥…
- 發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個(gè)體/組織/器官生長(zhǎng)發(fā)育、干細(xì)胞分化與命運(yùn)決定、衰老
- 環(huán)境暴露與響應(yīng)：污染、抗逆、生活方式
關(guān)于m6A甲基化研究思路
（1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數(shù)量變化、m6A修飾基因數(shù)量變化、單個(gè)基因m6A peak數(shù)量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析
（2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時(shí)序數(shù)據(jù)的分析策略、時(shí)序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示
（3）m6A甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析：Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)、m6A修飾目標(biāo)基因的篩選策略
（4）進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整體解決方案。
參考文獻(xiàn)：
McFadden MJ, McIntyre ABR, Mourelatos H, Abell NS, Gokhale NS, Ipas H, Xhemal?e B, Mason CE, Horner SM. Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine. Cell Rep. 2021 Mar 2;34(9):108798.
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項(xiàng)目文章 | 90天見刊，易基因m6A RNA甲基化(MeRIP)+轉(zhuǎn)錄組組學(xué)研究
